低溫保存管（cryo tube）中之一般菌種臨時存放及活化

A. 低溫保存管之臨時存放及解凍

1. 低溫保存管（cryo tube）應存放于－20℃ ~ －80℃之低溫條件下。

2. 準備 37℃之 70﹪（V/V）酒精浴槽（只能在電氣水浴槽中改放酒精，不可以火加溫，以免危險；若以 37℃水浴取代，應避免水中微生物污染），其中事先安放小試管架（可放置 cryotube 之大小），液面不可高達管塞。

3. 將 cryotube 從低溫保存條件中取出，置于 37℃浴槽之小試管架上。

4. 不斷輕微搖動 cryotube，液面不可高至管塞，直至結冰完全溶解（約需 2 分鐘）。

C. 菌株活化: 在無菌操作下

1. 用無菌微量吸管，從已溶解之 cryotube 吸取 50 ?l（或 1 ~ 2 滴）之菌液，滴入固態指定培養基（培養基編號及溫度示于菌株訂購單）某一邊緣附近，以劃線法接種于培養基。

2. 將接種好的培養基置于指定溫度的培養箱中培養。

D. 圖示

（1）金屬接種環

（2）平板劃線法

冷凍干燥管之開管說明

下列步驟請在無菌環境下操作：

1、以沾有70%酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加熱外管之**。

2、滴數滴無菌水于加熱處，使外管破裂，再以硬棒敲破**。

3、取出隔熱纖維紙和內管，以滅菌過的鑷子取出內管之棉塞。

4、（ a ） 適用于細菌
用無菌吸管，吸取0.3-0.5 ml指定之液體培養基，滴入內管內，并輕微震蕩（可用該吸管協助），直到均勻懸浮。
（ b ） 適用于霉菌、酵母菌
用無菌吸管，吸取0.3-0.5 ml無菌水，滴入內管內，待干燥粉末溶解后，以無菌吸管吸取并滴入約含有5ml無菌水之試管內，輕微震蕩使其均勻后，靜置30至60分鐘。

5、取0.1-0.2 ml之菌體懸浮液于指定的平板培養基上，做劃線分離培養或做成一系列之稀釋，用無菌L型玻棒均勻涂抹，以檢驗菌種之純度及活化情形，而剩余的菌體則全部移入指定的液體培養基內，并依指定的溫度培養之。

6、某些菌種經過冷凍干燥保存后，遲滯期 （ lag period ） 較長，必須等培養二倍時間后才能長出，且再經過一、二次繼代培養 （Subculture） 后才能正常生長。經過以上的努力后仍培養失敗，才視為不能活化。

7、若菌種未能活化，或活化之菌落有疑問時，請于收到菌種之一個月內，以問題菌株反應單傳真至本中心，即進行處理。

8．未開封之冷凍干燥管，請冷藏于4℃冰箱，切勿冷凍保存。

B. 劃線法

1. 手持金屬接種環，用酒精燈將接種環（共約 5 公分）燒至火紅，并不斷來回燒烤金屬固定桿之前約10 公分，等待約 10 秒鐘，將接種環前端輕觸培養基邊緣凝膠（無菌體部份），待接種環完全冷卻后，以環沾黏菌滴，由培養基邊緣向中央輕輕橫劃緊接的并行線，直到涵蓋 1/3 培養基為止（I區）。

2. 灼燒接種環，待數秒冷卻后，旋轉培養基自 I 區涂布的邊緣再橫劃數條線到未接種的區域（II區）。

3. 重復 2. 的動作完成 III 區與 IV 區。

4. 灼燒接種環，將接種環歸位。