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PCR
技術(shù)支持

DNA專題：從動(dòng)物肝臟中提取DNA
一、原理 ：
       在濃氯化鈉（1―2mol/L）溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的溶解度很小，在稀氯化鈉（0.14 mol/L）溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同濃度的氯化鈉溶液，將脫氧核糖核蛋白和核糖核蛋白從樣品中分別抽提出來(lái)。
      將抽提得的核蛋白用SDS（十二烷基硫酸鈉）處理，DNA或（RNA）即與蛋白質(zhì)分開(kāi)，可用氯仿―異戊醇將蛋白質(zhì)沉淀除去，而DNA則溶解于溶液中。向溶液中加入適量乙醇，DNA即析出。
為了防止DNA或（RNA）酶解，提取時(shí)加入EDTA（乙二胺四乙酸）

      二、實(shí)驗(yàn)材料與儀器 ：
      1、小白鼠肝臟
      2、勻漿器
      3、離心機(jī)5000r/min
      4、量筒50ml（×1），25 ml（×1），10 ml（×1）
      5、 吸管5 ml（×2）
      6、水浴鍋
      7、真空干燥器

      三、試劑 ：
      1．5 mol/L NaCl 溶液：將292.3g NaCl 溶于水，稀釋至1000ml。
      2．0.14mol/L NaCl―0.15mol/L EDTA―Na 溶液： 溶8.18g NaCL 及37.2g EDTA―Na 于蒸餾水，稀釋至1000ml。
      3．25% SDS 溶液： 溶25g 十二烷基硫酸鈉于100ml 45% 乙醇
      4．0.015 mol/L  NaCL―0.0015 mol/L 檸檬酸三鈉溶液： 氯化鈉 0.828 g及檸檬酸三鈉0.341g 溶于蒸餾水，稀釋至1000ml。
      5．氯仿―異戊醇混合液：氯仿：異戊醇=24：1（V/V）。
      6．1.5 mol/L NaCL―0.15 mol/L檸檬酸三鈉溶液：氯化鈉 82.8 g 及檸檬酸三鈉34.1 g溶于蒸餾水，稀釋至1000ml。
      7．3 mol/L乙醇鈉―0.001 mol/L EDTA―Na溶液： 稱取乙酸鈉 408 g，EDTA―Na 0.372g 溶于蒸餾水，稀釋至1000ml。
      8．70%乙醇，80%乙醇，95%乙醇，無(wú)水乙醇。
      9．二苯胺試劑
      10．1 mol/L過(guò)氯酸溶液：將10ml過(guò)氯酸（70%）用蒸餾水稀釋至110ml。

      四、操作 ：

      1． DNA的分離純化：
      （1）將10頭小白鼠迅速殺死，取出肝臟，用0.14mol/LNaCl―0.15mol/l EDTA溶液洗去血漿，剪碎，加入50ml0.14mol/L NaCl―0.15mol/lEDTA溶液，置勻漿器中研磨，待磨成糊狀后，將糊狀物離心10分鐘（4000r/min），棄去上清液，沉淀用0.14mol/LNaCl―0.15mol/L EDTA溶液洗二、三次，所得沉淀為脫氧核糖核蛋白粗制品。
      （2）向上述沉淀物加入0.14mol/LNaCl―0.15mol/L EDTA溶液，使總體積為44ml，然后滴加25% SDS溶液 3ml，邊加邊攪拌，加畢，置60水浴保溫10分鐘（不停攪拌）溶液變的粘稠并略透明，取出冷至室溫。此步操作是使核酸與蛋白質(zhì)分離。
      （3）加入5mol/LNaCL10ml，使NaCl *終濃度達(dá)到1mol/L，攪拌10分鐘，加入月約一倍體積的氯仿―異戊醇混合溶液，振搖20分鐘，離心10分鐘（4000r/min）。去掉沉淀，上層清液徐徐加入1.5―2倍95%乙醇，DNA沉淀即析出，用玻棒慢慢攪動(dòng)，則DNA絲狀物即纏在玻棒上。
      （4）將DNA粗品置于27ml  0.015 mol/L  NaCl ―0.0015 mol/L檸檬酸三鈉溶液中，再加入3ml1.5 mol/L NaCl―0.15 mol/L檸檬酸三鈉溶液，攪勻,加入一倍體積氯仿―異戊醇混合液，振搖十分鐘，離心（4000r/min，10分鐘），傾出上層液體（沉淀?xiàng)壢ィ尤?.5倍體積95%乙醇，DNA即沉淀析出。離心，棄去上清液，沉淀（粗DNA）按本操作步驟重復(fù)處理一次。
      （5）將上步所得沉淀于27ml  0.015 mol/L  NaCl―0.0015 mol/L檸檬酸三鈉溶液中，然后以線狀徐徐加入2倍95%乙醇，邊加邊攪，取出絲狀DNA，依次用70%，80%，95%以及無(wú)水乙醇各洗一次，真空干燥。

      2． 鑒定： 用二苯胺法測(cè)定DNA。

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